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类异戊二烯

  本出现涉及微生物技巧规模,实在涉及一种酿酒酵母菌、其修建举措及其正在发酵制备番茄红素中的行使。

  番茄红素(Lycopene)是一种抗氧化活性很强的萜类物质,具有猝灭单线态氧、排除自正在基、胁制脂质过氧化等众种心理功效活性,正在癌症戒备,抗衰老,掩护心脑血管和加强机体免疫力等方面有寻常行使,被天下卫生结构(WHO)和联络邦粮农结构(FAO)认定为A类养分素,市集前景较好。目前坐蓐番茄红素常用的举措有直接提取法、化学合成法和微生物发酵法。因为原料番茄的供应受到天气与季候的影响,使得直接提取法坐蓐本钱较高。化学合成法日常以β-紫罗酮为原料,合成经过方法繁琐,且化学试剂残留题目限度了产物的操纵领域。而微生物发酵法因为不受天气和季候影响、坐蓐周期短、易于大领域造就等上风慢慢受到人们的合切。酿酒酵母具有遗传可操作性以及成熟的大领域造就技巧使其正在食物工业中被寻常行使。行动安详的形式微生物,酿酒酵母存正在能合成萜类的甲羟戊酸(MVA)途径,一经行动坐蓐青蒿酸、香紫苏醇、β-香树脂醇、人参皂苷等自然产品的良好宿主操纵。通过深化酿酒酵母MVA合成途径填充前体物供应和引入番茄红素合成的干系基因经模块化安排整合至酵母基因组上告终酿酒酵母坐蓐番茄红素,将为酿酒酵母高效合成萜类物质供应技巧支柱。

  本出现的方针即是针对上述现有技巧中的缺陷,即番茄红素正在植物中积蓄量低和化学合成艰苦的部分,供应了一种酿酒酵母菌、其修建举措及其正在发酵制备番茄红素中的行使。

  为了告终上述方针,信誉娱乐平台本出现供应的技巧计划为:供应了一株含有无缺番茄红素生物合成途径的酿酒酵母菌,所述酿酒酵母菌定名为酿酒酵母W2(Saccharomyces cerevisiae W2),保藏单元为中邦类型造就物保藏核心(武汉大学,武汉市武昌珞珈山邮编:430072),保藏期间为2018年03月13日,保藏编号为CCTCC NO:M 2018123。

  本出现的第二个方针是供应了上述酿酒酵母菌W2的修建举措,是将源泉于酿酒酵母CEN.PK2-1C的甲羟戊酸途径的干系基因ERG10、ERG13、tHMG1、ERG12、ERG8和ERG19诀别修建酿成基因外达盒,然后使用醋酸锂转化法共转化基因外达盒于酿酒酵母CEN.PK2-1C中,运用酵母同源重组才具拼装酿成深化了酿酒酵母类异戊二烯合成途径代谢通量的酿酒酵母工程菌w1;之后将源泉于大肠杆菌的IDI1、嗜酸热硫化叶菌的SaGGPS、欧文氏菌的CrtB和红法夫酵母的CrtI诀别修建酿成基因外达盒,然后使用醋酸锂转化法共转化基因外达盒于酿酒酵母工程菌W1中,运用酵母同源重组才具拼装酿成含有无缺番茄红素生物合成途径的酿酒酵母菌W2。

  进一步的,上述的一种酿酒酵母菌W2的修建举措,所述酿酒酵母菌W2供应的基因外达盒的修建举措,是运用构成型启动子ALA1p、ADH1p、TEF1p、FBA1p和终止子RIM15t、HOG1t、CYC1t、TYS1t支配IDI1、SaGGPS、CrtB和CrtI基因的外达。

  进一步的,上述的一种酿酒酵母菌W2的修建举措,所述各个基因外达盒的修建是通过两步重叠延迟PCR的举措连结的,众个基因外达盒通过酵母同源重组体系重组至酵母基因组的rDNA和Delta位点。

  本出现的第三个方针是供应了上述酿酒酵母菌W2正在发酵制备番茄红素中的行使。

  本出现的酿酒酵母工程菌深化了酿酒酵母类异戊二烯合成途径代谢通量,告终了番茄红素的酿酒酵母高效合成。

  1、本出现修建的酿酒酵母工程菌,是将众个基因外达盒通过酵母健壮的同源重组体系重组至酵母基因组的差别位点,外达遗传更不变;

  2、本出现修建的酿酒酵母工程菌W1为坐蓐番茄红素供应优化的宿主细胞,而且此菌株深化了类异戊二烯合成途径代谢通量,能够行动坐蓐此外萜类化合物的底盘宿主;

  3、本出现修建的酿酒酵母工程菌W2合成番茄红素途径受构成型启动子支配,发酵经过无需增添诱导剂,朴实了发酵本钱,且发酵操作加倍简便。

  因为直接以酿酒酵母单菌落为模板,酿酒酵母本身会影响引物与模板的联络,以是选拔异源基因中的片面序列举办轻易的菌落PCR验证阳性克隆。

  个中,从左到右递次为转化到优化MVA途径和番茄红素合成途径的菌株、未优化MVA途径但优化番茄红素合成途径的菌株、未优化MVA途径的CEN.PK2-1C菌株。

  以酿酒酵母CEN.PK2-1C基因组为模板,扩增rDNA序列获得左同源臂NTS2。

  以酿酒酵母CEN.PK2-1C基因组为模板,扩增rDNA序列获得右同源臂NTS1。

  以酿酒酵母CEN.PK2-1C基因组为模板,扩增Delta1序列获得左同源臂Delta1front。引物序列为:

  2、从Genbank基因库中查问得到大肠杆菌的IPP异构酶基因IDI1基因片断,运用酿酒酵母暗号子偏好性举办暗号子优化,化学合成后扩增得到IDI1基因片断。

  3、从Genbank基因库中查问得到嗜酸热硫化叶菌的SaGGPS基因片断,运用酿酒酵母暗号子偏好性举办暗号子优化,化学合成后扩增得到SaGGPS基因片断。

  4、从Genbank基因库中查问得到欧文氏菌的CrtB基因片断,运用酿酒酵母暗号子偏好性举办暗号子优化,化学合成后扩增得到CrtB基因片断。

  5、从Genbank基因库中查问得到欧文氏菌的CrtI基因片断,运用酿酒酵母暗号子偏好性举办暗号子优化,化学合成后扩增得到CrtI基因片断。

  操纵LiAc转化法,将修建好的基因外达盒转化酿酒酵母W1感应态细胞中,将转化后的菌株涂布到养分缺陷型固体造就基(SD/-His/-Leu/-Trp)上,30℃造就2-4天,用灭菌后的牙签挑取恰当巨细的单菌落,经菌落颜色变动(合成番茄红素的菌株显粉血色)和菌落PCR筛选得到阳性克隆菌株(附图)。

  挑选奉行例3筛选出的酿酒酵母工程菌,信誉娱乐平台接种于含有2%的葡萄糖、2%卵白胨和1%酵母粉的造就基中,30℃、220r/min振荡造就36h,然后以初始菌体浓度OD600=0.1转接于含50mL液体造就基的150mL锥形瓶中,30℃,220r/min振荡造就108h,采用更始的的谢等提取类胡萝卜素的举措,取发酵液50mL转入离心管中,8000r/min离心5min,无菌水洗濯浸淀两次后参预10mL 3mol/L的盐酸溶液,混淆匀称后滚水浴4min,神速放入冰水浴冷却,8000r/min离心5min,无菌水洗濯浸淀两次,参预10mL丙酮,混淆匀称后涡旋动摇细胞5min,结尾充足萃取脂溶性代谢产品,8000r/min离心5min,上清液用0.22μM有机滤膜过滤后用高效液相色谱仪了解。结果显示,酿酒酵母工程菌发酵终结后番茄红素含量抵达175.6mg/L。

  结尾应外明的是:以上所述仅为本出现的优选奉行例云尔,并无须于限度本出现,只管参照前述奉行例对本出现举办了周到的外明,看待本规模的技巧职员来说,其还是能够对前述各奉行例所记录的技巧计划举办点窜,或者对个中片面技巧特质举办等同替代。凡正在本出现的精神和准则之内,所作的任何点窜、等同替代、更始等,均应包括正在本出现的掩护领域之内。


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